生物质谱——蛋白质组学研究的肱股之臣

2017年12月01日 13:34:25 来源: 分析测试百科
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  分析测试网讯 2017年11月29日,由北京大学,首都科技条件平台主办,安特百科(北京)技术发展有限公司(金沙城国际娱乐_金沙娱乐手机网址【注册送彩金】_金沙城网上娱乐平台)协办的题为“生物质谱蛋白质组学研究中的应用”的讲座在北京大学化学与分子工程学院化学楼A201报告厅举办,来自蛋白质行业的专家学者参与了此次讲座。

北京大学分析测试中心、美国密西根大学分析化学博士 周 文

  此次讲座主讲人为北京大学分析测试中心、美国密西根大学分析化学博士周文,讲座分为三个部分,第一部分介绍了质谱的原理,然后是质谱在蛋白质组学研究中的应用,最后介绍北京大学分析测试中心质谱金沙城及其应用。

  质谱原理:

  周文以Obitrap为例:质谱仪是非常精密的大型金沙城国际娱乐,有非常多的附件在其中,日常客户中主要关心的部分:

  1:离子源:对于生物大分子来说,现在应用最广的是电喷雾ESI,相对于之前很多离子化方法电是相当温和的,我们称之为软电离,2002诺贝尔化学奖颁给John Fenn和Koichi Tanaka,两位科学家,John Fenn凭借ESI,Koichi Tanaka凭借MALDI获奖。在很多年前,质谱用的都是能量非常强的离子化方法,有机小分子结构稳定,能完整的进入质谱里边去,质谱用来分析相对小一些的分子。直到ESI和MALDI广泛应用之后,相当于给生物大分子蛋白研究这头大象插上了翅膀,自从有了ESI和MALDI之后,才有了蛋白质组学比较蓬勃的发展。

  2:质量分析器:种类很多,在蛋白质组学分析中,主流的是一类是轨道阱

  Obitrap,优点:高分辨率,高精度,高灵敏度。现在最高灵敏度,高精度的是FTMS,Obitrap相较于FTMS来说,虽然指标和性能上稍微差一点,但是维护和使用上相对比较容易,所以Obitrap现在作为蛋白质组学研究的一类主流的使用金沙城国际娱乐。

  质谱在蛋白质组学中的应用:

  蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学,分为若干个层次,第一层次:测完整蛋白的分子量,第二层次,蛋白序列,通过鉴别蛋白序列,得到到底是什么样的蛋白,第三层次,蛋白修饰;有什么样的修饰,修饰的位点在哪,前三个层次是蛋白的定性,第四个层次是定量的问题,尤其是当我们研究到蛋白质组时,更加必要。

  蛋白质组学的实验流程:相对比较纯化的蛋白,通过酶进行特异位点的酶切,切成几十上百的段,肽段进入液质联用,得到质谱谱图,母离子的是一级谱图,碎片扫描的是二级谱图,然后做数据库的处理,与数据库里谱图对比。

  质谱一级谱图和二级谱图:

  一级谱图:不做碎片,在一个范围进行扫描,可以得到准确的分子量,但是却不能知道是什么肽段,因为不知道里边的氨基酸是怎么排列的,所以还需要做二级碎裂,得到它的碎片,

  才能确定是肽段的碎裂。同理二级碎裂也可以得知在哪个位点上有修饰。

  实验流程讲完之后,周文又举了几个例子:

  案例一:未知蛋白的鉴定:未知蛋白经过酶切成肽段,肽段进入LC-MS得出谱图,搜索蛋白库,没有结果,然后测序High five细胞株转录组(High five昆虫细胞:常用于杆状病毒表达载体系统的重组蛋白表达),预测全蛋白序列,重新搜库,最后查到相对应的蛋白。

  案例二:蛋白质修饰位点的鉴定:蛋白的翻译后修饰在众多生命活动中都起到非常重要的调控作用,很多课题组想找到蛋白都什么样的修饰,但是用质朴鉴定的难点:修饰率低:修饰可能不稳定;像一些糖基化修饰不会留在肽段上面。对于修饰率低的问题,解决方案是富集含有修饰的肽段,用抗体,磷酸化等,把不带修饰的肽段排除出去,留下的肽段全是带修饰的肽段;修饰不稳定问题,现在最常用的是CID/HCD都是碰撞类的解离,现在应用比较少的是电子转移阱(ETD)。ETD在分析比较脆弱的修饰有其独特的优势。

  CID/HCD与ETD碎裂方式的对比图

  案例三:基于二甲基化反应的相对定量:Hela细胞经过非天然糖代谢标记、富集蛋白,得到了的蛋白经过酶切得到肽段,肽段经过二甲基标记,得到轻组和重组的肽段,1比1混合,这个时候做一个二维的色谱分析,最后定量得到3200个蛋白,置信度很高。

  北京大学分析测试中心质谱金沙城

  北京大学分析测试中心现有金沙城国际娱乐:傅里叶变换高分辨质谱、轨道阱、飞行时间质谱、三重四级杆、高分辨气质联用仪、离子淌度质谱等,讲座结束后,周文邀请与会专家学者参观分析测试中心,专家学者就质谱相关的问题与周文详细探讨。

  专家学者参观北京大学分析测试中心质谱室

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